Se procede a subcultivar las cepas a utilizar en dicho proyecto, para ello se prepara el medio de cultivo Ashby's-Manitol-Agar de la casa comercial SIGMA® y se chorrea en platos petri. Las descripciones de los autores de las cepas, se usarán como iniciales de cada una de las cepas a utilizar.
Entonces tenemos que:
AzINA1: Cepa de Azotobacter spp. del INA #1
AzINA2: Cepa de Azotobacter spp. del INA #2
AzAlex: Cepa de Azotobacter spp. Alex
Metodología empleada:
Se subcultivaron por rayado muy homogéneo las cepas de Azoobacter spp. utilizando una asa bacteriológica; esto bajo las siguientes condiciones de cultivo: 30ºC durante 48 horas.
Asimismo se dejó un control del medio de cultivo
Jueves 26 de Agosto
No se veían resultados promisorios en el subcultivo de las cepas; sin embargo las cepas del INA estan respondiendo al medio de cultivo mientras que la cepa AzAlex no mostraba alguna respuesta. (No se cuentan con fotos de la prueba).
Cabe rescatar las siguientes condiciones de las cepas a utilizar, antes de empezado el ensayo:
AzINA1 y AzINA2: Se encontraban bajo refrigeración a 4 ºC
AzAlex: Se encontraba revitalizada en una placa de cultivo, cuyo medio aun se desconoce (Se debe de consultar a Alex). y venía contaminada con una colonia de aspecto lechoso color amarilla.
Viernes 27 de Agosto
Se volvió a preparar el medio de cultivo Ashby's-Manitol-Agar de la casa comercial SIGMA®, y se procede a utiliza las técnicas de cultivo tipo rayado en placa por estrías y por "aislamiento de colonias", el cual pretende ayudar a una mejor respuesta por parte de las bacterias de Azotobacter spp. utilizadas en dicho ensayo.
De la misma forma, tambien se dejó un control del medio de cultivo. Y las condiciones de cultivo fueron las mismas utilizadas en el primer ensayo.
Martes 31 de Agosto
Se procede a revisar las placas del ensayo.
Se observa que el crecimiento no es suficiente aún, para poder realizar la inoculación en medio líquido; asimismo se observa que al poner la placa de cultivo de la cepa AzINA1 contra la luz el medio se observa azul en las zonas en donde la bacteria ha crecido.
La cepa AzINA2 muestra un crecimiento mayor que la otra cepa del INA.
La cepa de Alex no muestra un crecimiento, y se concluye que no responde a las condiciones establecidas en el ensayo.
Se procede a subcultivar nuevamente todas las cepas en el medio de cultivo Ashby's-Manitol-Agar de la casa comercial SIGMA®,
Se considera importante conocer los compuestos químicos del medio de cultivo, y se muestran a continuación:
Compuesto Cantidad (g/L)
Fuente de Energía (Manitol, Glucosa, Sacarosa) 20,00
Fosfato dipotasio 0,20
Sulfato de Magnesio 0,20
Cloruro de Sodio 0,20
Sulfato de Potasio 0,10
Carbonato de Calcio 5,00
Agar 15,00
Condiciones finales: 7,2 de pH al utilizar Manitol; según SIGMA®,
Se procede también a preparar otro ensayo; en el cual se desean valorar las siguientes variables en el crecimiento de la bacteria:
Se procede también a preparar otro ensayo; en el cual se desean valorar las siguientes variables en el crecimiento de la bacteria:
- Respuesta al cultivo en Medio Líquido
- Respuesta a la agitación en diferentes recipientes (tubos de ensayo con 10 mL de medio de cultivo Ashby's-Glucosa y erlenmeyers de 250 mL con 25 mL de medio de cultivo Ashby's-Glucosa )
- Respuesta a la fuente de carbono Glucosa
Condiciones de cultivo utilizadas:
- Velocidad de Agitación: 110 rpm
- Tº de incubación: 30 ºC
- Medio de cultivo: Ashby's-Glucosa
- Hora de incubación: 09:00 a.m.
También se procede a realizar un ensayo de medición de la temperatura en la incubadora utilizada, para determinar si existen variables que puedan afectar el desarrollo de este proyecto.Luego de 5 mediciones, se obtienen los siguientes resultados:
Cuadro 1. Resultados de las mediciones de temperatura de la incubadora en el INA
Asimismo se obtienen las siguientes observaciones:
- Cuando la puerta (interna de vidrio) de la incubadora no se cierra bien se baja la temperatura,
- Las mediciones muestran que la temperatura varía en rangos entre los 29 y 31 ºC, a diferencia de lo que marca el termómetro de la incubadora que siempre muestra rangos entre los 30 y 31 ºC.
- Se toman dichas observaciones como respaldo para las pruebas a realizar utilizando la incubadora
Miércoles 1 de Setiembre
Se procede a incubar los medios de cultivo líquidos para incubarlos en el shaker del INA. Para dicha incubación se procede a pasar una asada del cultivo bacteriano dentro de los tubos y los erlenmeyers.
Se realizan los conteos iniciales.
Cuadro 1. Resultados de las mediciones de temperatura de la incubadora en el INA
Fecha de la medición Hora Temperatura registrada (ºC) Temperatura Medida (ºC)
31 de Agosto 2:56 p.m. 31 31
1 de Setiembre 9:02 a.m. 31 31
1 de Setiembre 1:00 p.m. 31 30
2 de Setiembre 9:00 a.m. 31 31
2 de Setiembre 2:28 p.m. 31 31
6 de Setiembre 8:36 a.m. 30 29
6 de Setiembre 2:15 p.m. 31 30
Asimismo se obtienen las siguientes observaciones:
- Cuando la puerta (interna de vidrio) de la incubadora no se cierra bien se baja la temperatura,
- Las mediciones muestran que la temperatura varía en rangos entre los 29 y 31 ºC, a diferencia de lo que marca el termómetro de la incubadora que siempre muestra rangos entre los 30 y 31 ºC.
- Se toman dichas observaciones como respaldo para las pruebas a realizar utilizando la incubadora
Miércoles 1 de Setiembre
Se procede a incubar los medios de cultivo líquidos para incubarlos en el shaker del INA. Para dicha incubación se procede a pasar una asada del cultivo bacteriano dentro de los tubos y los erlenmeyers.
Se realizan los conteos iniciales.
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