Metodología (Resumen de la Propuesta)

El presente trabajo se realizará en el invernadero de agricultura orgánica del Instituto Nacional de prendizaje, en conjunto con el Laboratorio de Fitoprotección de dicha institución. Asimismo parte de la medición química de la cantidad de nitrógeno presente en las muestras a analizar se realizará en el Laboratorio de Docencia de la Escuela de Biología del Instituto Tecnológico de Costa Rica.

Esta investigación tiene como fin estudiar el efecto de la aplicación de diferentes concentraciones de dos cepas de Azotobacter spp. Aisladas por Schmidt (2010) y por el Laboratorio de Fitoprotección del INA, en la Chinchilla de Cartago. Para ello se utilizará el Caldo Winogradsky (Molina, 1957); el cual brindó los mejores resultados de crecimiento para la cepa de Azotobacter spp. aislada por Schmidt (2010). Las variables a analizar serán las misma que analizó Caicedo y Suquilanda (2007) en su investigación, donde analizaron: la altura de la planta, el diámetro de planta, el peso promedio por planta, la producción, su ciclo vegetativo y determinaron un análisis económico.

En síntesis la metodología a utilizar se resume en los siguientes puntos:

 1- Revitalización de las cepas crioconservadas de Azotobacter: Para ello se cultivarán las cepas en caldo Winogradsky. La cepa madre se inocula en los tubos con el medio (10 mL), bajo condiciones de esterilidad y se incuba a 30°C por 24 horas (Schmidt, 2010).

2- Formulación del biofertilizante a partir de las cepas de Azotobacter (Schmidt, 2010; Agüero, 2009 y González, 2000):

 Para la preparación del pre inoculó se toman en cuenta los siguientes requisitos:

• El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre de contaminantes.
• El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de desarrollo). Para ello se evalúa el crecimiento bacteriano durante 30 horas que es el tiempo estimado que tarda en alcanzar la fase exponencial. Se procura obtener pre inóculos con una concentración de biomasa del orden de 108-109 células/ml.
• Se debe dispones de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el volumen de medio liquido a utilizar en la fermentación, el cual debe estar entre el 3–10% del volumen total a fermentar. En este caso se trabaja con un volumen equivalente al 10% del volumen total a fermentar.
• Una vez pasado el tiempo de cultivo de las cepas revitalizadas, se procede a inocular en condiciones de esterilidad, en 90 mL de caldo de cultivo Winogradsky, y se incuban en agitación de 100 rpm a 30 ºC por 24 horas. En un matraz de 250 ml.
• Este procedimiento de cultivo es con el fin de obtener 10 matraces de cultivo.
• Cada día se determinará la concentración de células con el fin de establecer la curva de crecimiento en el medio de cultivo; esto con el fin de conocer y optimizar las condiciones de cultivo de Azotobacter en el medio de cultivo indicado como óptimo. Para ello se tomarán 2 mL de cada medio de cultivo en un erlenmeyer estéril en condiciones asépticas y se inoculará aproximadamente una gota en una cámara de Neubauer donde se realizará el conteo de la cantidad de células por división del cuadrante utilizando un microscopio. Posteriormente se sumará el conteo realizado y se multiplicará por el factor de conversión de la cámara, para obtener la concentración del microorganismo por mililitro del medio de cultivo. 

3- Preparación del las camas para el cultivo hidropónico de lechuga (Lastra, 2009; Aruani1 et al, 2008): en este caso se utilizarán 4 camas de cultivo cuyas dimensiones son de 1,30 x1,30 m. y las cuales se ubican en el invernadero de agricultura orgánica del INA. Asimismo se preparará el sustrato a utilizar a partir de tierra con la cual cuenta la institución en su finca, a la misma se le aplicará un tratamiento de esterilización por vapor en un autoclave. Posterior a ello, también se esterilizará granza de arroz, la cual también pasará por el mismo proceso de esterilización. La composición final del sustrato será de un 80% tierra y un 20% granza de arroz.

4- Compra de almácigos de lechuga y transplante a camas: Se comprarán en la Chinchilla de Cartago.

5- Aplicación de los cuatro tratamientos a las plántulas de lechuga: Se utilizarán tres tratamientos una vez transplantadas las plántulas a excepción del tratamiento de sumergido de raíces, dichos tratamientos se basan en las pruebas de González (2000) y Caicedo y Suquilanda (2007) suplementadas con la adición de un 50% de la cantidad de nitrógeno requerido por las plántulas de lechugas (0,75g/plántula) según Meléndez ( 2003); los cuales se describen a continuación:

a. Sumergido de raíces; sumergiendo por un tiempo de 30 minutos las raíces de las plántulas en la solución contenedora del medio de cultivo con Azotobacter.

b. Inyección en Suelo; utilizando una bomba de aspersión, y a una cantidad aplicada de 100cc/l de Azotobacter para la dosis uno. Aplicando 8 mL/planta más 0,75 g de Abono nitrogenado aplicado como Nitrato de Amonio.

c. Inyección en Suelo; utilizando una bomba de aspersión, y a una cantidad aplicada de 200cc/l de Azotobacter para la dosis dos. Aplicando 8 mL/planta más 0,75 g de Abono nitrogenado aplicado como Nitrato de Amonio.

d. Inyección en Suelo; utilizando una bomba de aspersión, y a una cantidad aplicada de 300cc/l de Azotobacter para la dosis tres. Aplicando 8 mL/planta más 0,75 g de Abono nitrogenado aplicado como Nitrato de Amonio.

e. Control positivo, donde se aplicará el 100% de abono nitrogenado que la plántula de lechuga requiere. Se recomienda que por ha sean 100 Kg de Nitrógeno aplicado como Nitrato de Amonio; alrededor de 1,5 g de Nitrógeno por planta, según El Ministerio de Agricultura y Ganadería que establece se pueden producir 66 000 plantas de lechuga por hectárea.

6- Seguimiento de los resultados: Se establecerá el sistema de riego por nebulización una vez por día durante 30 min (Meléndez, 2003). Cualquier enfermedad o plaga detectada, en caso de darse será controlada de inmediato y si el daño al material es severo se descartará del ensayo. Asimismo se determinarán una vez haya terminado el ciclo de cultivo la planta, los siguientes parámetros: Altura de la planta (Sin tomar en cuenta el tamaño de las raíces), diámetro de planta, peso promedio por planta, producción (en cantidad de hojas), y el análisis económico de cada uno de los ensayos (esto según los gastos incurridos en el manejo del cultivo de cada uno de los tratamientos) (Caicedo y Suquilanda, 2007).

7- Determinación del Nitrógeno consumido por las plántulas de lechuga (Valdés et al., 2004): para la determinación del nitrógeno consumido por las plantas de lechuga se determinará por Colorimetría por nitración con ácido salicílico; esto se da gracias a que el complejo formado por nitración de ácido salicílico bajo condiciones fuertemente ácidas presenta máxima absorción a una longitud de onda de 410 nm en soluciones básicas (pH > 12). La absorbancia del cromóforo es directamente proporcional a la cantidad de N-NO3- presente en la muestra. Los iones NH4+, NO2- y Cl- no interfieren. Se trabaja en tubos con muestra y contramuestra, para eliminar el efecto de la absorción provocada por los pigmentos vegetales y así cuantificar solamente la absorbancia del complejo formado. A continuación se detalla el procedimiento a seguir.

a. Extracción del N-NO3: ebullición de 0.5 g de muestra en 50 ml de agua destilada durante 30 minutos.

b. Filltración y transferencia cuantitativa a matraz de 50 ml.

c. Pipeteo de alícuotas de 0.2 ml de extracto por duplicado en tubos de vidrio de 25 ml (tubo testigo y tubo problema).

d. Adición al tubo problema de 0.8 ml de solución de ácido salicílico al 5 % (p/v) en ácido sulfúrico concentrado. Adición de 0.8 ml de ácido sulfúrico concentrado al tubo testigo.

e. Adición lenta, transcurridos 20 minutos, de 19 ml solución 2N NaOH a cada tubo.

f. Desarrollo de color durante 24 horas (color estable hasta 72 hs).

g. Preparación de soluciones patrón de NO3- con 10, 20, 30, 40, 50, 75 y 100 mg/g a partir de una solución madre de 1000 mg NO3K/g.

h. Pipeteo de alícuotas de 0.2 ml de las soluciones patrón. Adición a cada tubo de los mismos reactivos que para el tubo problema.

i. Lectura de la absorbancia de las soluciones patrón en un espectrofotómetro de doble haz a longitud de onda = 410 nm. Con los valores obtenidos se ajusta una recta de regresión y se calcula el coeficiente angular (m) para establecer la concentración del N-NO3- en las muestras problema.

j. Lectura de la absorbancia (Absmuestra) de cada muestra con su blanco.
k. Cálculos:

• µg N-NO3/g = m * Absmuestra * 50 ml / peso de muestra (g)
• µg NO3 -/g = µg N-NO3/g * 4.43

8- Análisis de resultados: Los datos experimentales obtenidos serán procesados estadísticamente mediante un análisis de varianza de clasificación doble sin interacción y las medias se compararán mediante la prueba de Duncan a una probabilidad de error al 1% (p<0.01), usando el paquete estadístico “STATISTICA” para Windows (FAOSTAT, 2001). Además se hará una valoración económica de los resultados experimentales obtenidos, según Pampin (1987), determinando los siguientes indicadores económicos: Costos de producción, ganancia, costo por peso, costo unitario y valor de la producción y rentabilidad.